DNA rekombinan

DNA rekombinan adalah DNA yang dihasilkan atau diciptakan dengan menggabung dua fragmen DNA. Penggabungan tersebut dapat dilakukan dengan menciptakan ujung rantai tunggal yang komplementer (saling berpasangan) yang disebut ujung kohesif. Dua fragmen masing-masing dengan ujung kohesif dicampur, sehingga saling mengikat, celah yang tersisa kemudian ditutup dengan menggunakan enzim DNA ligase. Penggabungan juga dapat dilakukan pada dua  fragmen DNA dengan ujung  tumpul dengan menggunakan enzim T4-ligase yang berasal dari bakteriofag T4.

Ujung kohesif  (Sticky end) adalah ujung dari fragmen DNA yang berbentuk lancip berupa rantai tunggal dan dapat terikat atau digabung dengan ujung kohesif lain yang komplementer. Penggabungan tersebut membutuhkan enzim ligase.  Ujung kohesif dapat diciptakan dengan menggunakan:

a.       Enzim endonuklease restriksi

b.      Enzim polimerase Taq

c.       Oligonukleotida penggabung

d.      Oligonukleotida adaptor 

Prinsip penciptaan DNA rekombinan dengan menggunakan enzim deoksi-ribonukleotida transferase: 

Prinsip: Dua fragmen DNA, masing-masing dijadikan ujung kohesif dengan menambah deoksiribonukleotida (dATP, untuk DNA yang satu dan dTTP untuk fragmen yang lain) dan enzim deoksiribonukleotida transferase. Dua fragmen dengan ujung kohesif yang dihasilkan, dapat digabung,  Celah yang terbentuk digabung  menggunakan enzim DNA ligase. 

Metode: Teknik ini merupakan teknik yang tertua (pertama kali digunakan) untuk menghasilkan DNA rekombinan. Dua fragmen DNA (misalnya A dan B) yang akan digabung diperpanjang salah satu ujungnya (yang searah dengan 5’ dan menghasilkan ujung kohesif), dengan menambah deoksiribonukleota (dATP dan dTTP) dan bantuan  enzim deoksiribonukleotida transferase. Pada fragmen DNA A ditambah dATP, sehingga membentuk rantai tunggal poli A (teknik ekor poli A) pada ujung 5’. Pada fragmen DNA B ditambah dTTP, sehingga membentuk rantai tunggal poli T  pada ujung 5’. Dua fragmen dengan ujung kohesif yang dihasilkan, dapat digabung,  karena A dan T komplementer. Celah yang terbentuk digabung  menggunakan enzim DNA ligase.

Prinsip penciptaan DNA rekombinan dengan menggunakan Enzim endonuklease restriksi.

Prinsip:  Enzim endonukleaase restriksi akan memotong DNA dibagian tengah, pada daerah yang disebut urutan pengenalan. Pemotongan tersebut menghasilkan fragmen dengan ujung kohesif atau tumpul. Dua fragmen yang dihasilkan dicampur (diikat) dan digabung. Dua fragmen ujung kohesif dapat digabung menggunakan enzim DNA ligase. Penggabungan juga dapat dilakukan pada dua  fragmen DNA dengan ujung  tumpul dengan menggunakan enzim T4-ligase yang berasal dari bakteriofag T4.